動(dòng)物神經(jīng)行為實(shí)驗(yàn)方法

一、Morris水迷宮系統(tǒng)的組成

Morris實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動(dòng)采集和SuperMaze軟件/VisuTrack分析系統(tǒng)組成。

1、Morris水迷宮裝置:主要由裝水的水池和一個(gè)可調(diào)節(jié)高度和可移動(dòng)位置的站臺(tái)所組成。

2、水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng):該系統(tǒng)的主要部件為攝像機(jī)、計(jì)算機(jī)和圖像采集卡等。這種系統(tǒng)有多種型號(hào),但工作原理和流程大致相似:攝像頭采集大鼠游泳圖像(模擬信號(hào))輸入到計(jì)算機(jī)中的圖像采集卡進(jìn)行模/數(shù)轉(zhuǎn)換,大鼠游泳的模擬圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像儲(chǔ)存于硬盤(pán)中,將數(shù)字圖像進(jìn)行圖像分析得到有關(guān)的測(cè)試參數(shù)。軟件分析系統(tǒng)能自動(dòng)地采集動(dòng)物的入水位置、游泳的速度、搜索目標(biāo)等所需時(shí)間、運(yùn)行軌跡和搜索策略等參數(shù),并可將所采集的各種資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

二、硬件選擇的注意事項(xiàng)

1、水池和站臺(tái)

對(duì)于水池的大小，存在一個(gè)人為選擇的問(wèn)題，看起來(lái)應(yīng)該統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其實(shí)并不容易。但是有個(gè)原則就是水池不能太小，站臺(tái)也不能太大。Morris初（1981年）用于大鼠的水池是直徑1.32米、高為0.6米，水池的水深為0.40米;但后來(lái)（1984年）改為直徑2.14米、高0.4米，水池的水深為0.25米。對(duì)于小鼠的實(shí)驗(yàn)水池，文獻(xiàn)中介紹的迷宮直徑差異巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，過(guò)小的水池使小鼠爬上平臺(tái)的偶然性增加，任務(wù)難度減小。過(guò)大的水池會(huì)使小鼠游泳路徑延長(zhǎng)，體力消耗過(guò)大，爬上站臺(tái)的機(jī)率減少。

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中所用水迷宮水池大多數(shù)為大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般為1m或1.2m，高0.5m。站臺(tái)一般為圓形，直徑可分為大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般為30cm。國(guó)外文獻(xiàn)中所用水迷宮水池大多數(shù)為大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站臺(tái)直徑10cm；而小鼠一般為1m到1.5m，高0.3m站臺(tái)直徑5cm。

型號(hào)：XR-XM101

2、 水溫

水的溫度要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程中恒溫。大鼠溫度范圍一般為25± 1℃，小鼠可能低一些，在18~22℃左右。有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)小鼠進(jìn)行了水溫對(duì)迷宮成績(jī)影響的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)27~28℃組的小鼠成績(jī)差，而17~18℃組和21~22℃組小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)沒(méi)有區(qū)別，所以，我們推薦小鼠水迷宮的實(shí)驗(yàn)用21~22℃水。水溫對(duì)潛伏期影響很大，特別是大鼠，如果溫度過(guò)高，大鼠在游幾次后漸漸適應(yīng)了迷宮環(huán)境，它就會(huì)把迷宮當(dāng)“浴盆”了，放進(jìn)去以后，就漂浮不動(dòng)；如果水溫過(guò)低，大鼠體溫下降很快，體力也會(huì)耗散太多，大鼠游泳能力不能堅(jiān)持很久，就會(huì)出現(xiàn)有幾次潛伏期突然增大的現(xiàn)象。甚至有些老鼠會(huì)出現(xiàn)較明顯的應(yīng)激反應(yīng)，比如說(shuō)會(huì)出現(xiàn)抽筋，腹瀉現(xiàn)象。水溫一般保持25度左右，另外氣溫也會(huì)導(dǎo)致水溫偏差過(guò)大，應(yīng)人為的調(diào)節(jié)水溫。所以就要求在水池的底部裝有可以恒定保持水溫的加熱棒或者其他加熱裝置了。

3、 光源

要保證水池水面上沒(méi)有光影，主要是要避免光線(xiàn)在水面的反射問(wèn)題，以免留在水面的光照影子被軟件的采集系統(tǒng)將光影和鼠的影子混淆；如果是白色的水池背景，就可以在水池上方用兩根條形的發(fā)散日光燈，這樣可以減少反射光在水面的背影；如果是黑色的水池背景，就在水池四個(gè)象限的上方放置4個(gè)60瓦的燈泡或25瓦的管燈，不用功率特別大的燈。燈泡的高度應(yīng)該足夠高，不能被攝像頭捕獲到。另外還可以在水池四周裝一圈簾子（顏色一般是黑色、淺藍(lán)色或者白色），這樣可以將光的影子擋住，又保持一定的透光度。同時(shí)也可以減少外界的人站在水池旁邊某個(gè)地方或走來(lái)走去，對(duì)大鼠形成一個(gè)不定的空間參照物。

4、 空間線(xiàn)索（參照物）

水池應(yīng)該置于一個(gè)較大的房間內(nèi)，池壁上懸掛兩個(gè)以上物體作為近距離視覺(jué)參照物，并在水池外房間內(nèi)有多種遠(yuǎn)距離視覺(jué)參照物。比如幾何圖形（正方形、三角形、圓形等）懸掛于水池以外的墻上，高度是必須讓大小鼠在游泳的時(shí)候看的見(jiàn)的范圍，所以應(yīng)該在其視平線(xiàn)以上，這些幾何圖形可以是寬5cm至15cm塑料板制成，高度是必須高過(guò)站臺(tái),可以用1m的線(xiàn)掛在水池周?chē)?；這些幾何圖形一般涂成黑色，因?yàn)閲X類(lèi)動(dòng)物對(duì)黑色比較敏感；這些幾何圖形一般不少于3個(gè)。另外實(shí)驗(yàn)室環(huán)境是一個(gè)十分重要的因素,實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備、儀器、工作臺(tái)、椅子、門(mén)窗和燈具等陳設(shè)的位置和實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所站立的位置都可能被大小鼠看見(jiàn)，如果移動(dòng)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)閯?dòng)物有時(shí)會(huì)常常利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)固有的環(huán)境作為它搜索目標(biāo)時(shí)的參照物。

三、實(shí)驗(yàn)流程準(zhǔn)則

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定空間學(xué)習(xí)記憶能力，主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)、反向試驗(yàn)和可視站臺(tái)試驗(yàn)等。在這里主要介紹下文獻(xiàn)里面主要做的隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)的流程準(zhǔn)則。

1、隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)

嚙齒類(lèi)動(dòng)物第yi次游泳時(shí),一般不會(huì)找到藏于水面下的不可見(jiàn)的站臺(tái)。若動(dòng)物在入水游泳60～90s以?xún)?nèi)仍未能找到水池中的站臺(tái)或未能爬上站臺(tái)時(shí),實(shí)驗(yàn)人員可將動(dòng)物引導(dǎo)置于站臺(tái)上站立10～30s,使動(dòng)物體會(huì)站在站臺(tái)上的感覺(jué),這樣從第二次開(kāi)始,學(xué)習(xí)成績(jī)就能迅速提高。動(dòng)物爬上站臺(tái)后,讓動(dòng)物在站臺(tái)上站立5～10s。將大鼠從站臺(tái)上拿下來(lái),休息30～60s以后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。在一般情況下,正常大鼠在經(jīng)過(guò)4～6個(gè)實(shí)驗(yàn)日訓(xùn)練后,很快就學(xué)會(huì)以z快z佳的軌跡搜索到站臺(tái)的確切位置。

每天開(kāi)始時(shí)，將鼠任意從四個(gè)象限（東北、西北、東南、西南）之一面向池壁放入水中，站臺(tái)放置于東南象限， 每次實(shí)驗(yàn)鼠共游泳60～90s來(lái)尋找隱藏的站臺(tái)。如果成功地找到站臺(tái)，鼠可以得到在站臺(tái)上的10～30s休息時(shí)間；如果60～90s內(nèi)未能成功的找到站臺(tái)，就由實(shí)驗(yàn)人員將鼠人工置于站臺(tái)上，且同樣給予10～30s的休息時(shí)間。有時(shí)鼠可能會(huì)在10～30s間隔時(shí)間到達(dá)之前從站臺(tái)上掉下或跳入水中繼續(xù)游泳。一旦這種情況發(fā)生，則將鼠重新放回站臺(tái)，并重新計(jì)時(shí)，使時(shí)間間隔到達(dá)（10～30s）。這樣可以確保每只鼠在每次實(shí)驗(yàn)后有相等的時(shí)間來(lái)觀察和獲取空間信息。

2、空間探索試驗(yàn)                      

隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束24h后，撤除站臺(tái)。然后任選一相同入水點(diǎn)將鼠放入水中，記錄鼠在60s或120s內(nèi)的游泳路徑，記錄鼠在原站臺(tái)象限的停留時(shí)間和穿越原站臺(tái)次數(shù)，觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過(guò)程中的變化規(guī)律。在電腦屏幕上用圓形環(huán)標(biāo)記出站臺(tái)原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺(tái)所在位置的次數(shù)。

實(shí)驗(yàn)流程準(zhǔn)則：

2.1、實(shí)驗(yàn)時(shí)間

隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)一般設(shè)計(jì)天數(shù)為4天或者6天，如果是年老體弱鼠可以將天數(shù)設(shè)計(jì)為4天。訓(xùn)練時(shí)間一般為60s或90s,也有用120s的，不過(guò)現(xiàn)在一般都改用60s了，有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，大鼠在60～120s之間能夠找到隱藏站臺(tái)的次數(shù)差異大約只占其找到平臺(tái)總次數(shù)的5%, 這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是“小概率事件”。也就是說(shuō), 大鼠在60s內(nèi)找不到隱藏站臺(tái)的話(huà), 再延長(zhǎng)到120s也很難找到。而且60s還可以減小各組的標(biāo)準(zhǔn)差, 可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。但問(wèn)題并非如此簡(jiǎn)單，隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)潛伏期應(yīng)采用重復(fù)測(cè)量, 由于在統(tǒng)計(jì)時(shí), 很多研究將大潛伏期直接納入統(tǒng)計(jì), 顯然, 大潛伏期的不同將不可避免地影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。所以從統(tǒng)計(jì)學(xué)上了解不同的大潛伏期到底對(duì)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果有多大的影響, 如何避免因此帶來(lái)的系統(tǒng)誤差等問(wèn)題尚有待進(jìn)一步研究。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，如果水池的直徑在2m，可以設(shè)置單次訓(xùn)練時(shí)間為120s,直徑在1m至1.5m,選擇訓(xùn)練時(shí)間為60s, 鑒于此，我們認(rèn)為訓(xùn)練時(shí)間60s較為合適。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)鼠體力消耗也會(huì)過(guò)大。

2.2、 實(shí)驗(yàn)次數(shù)

在隱藏站臺(tái)試驗(yàn)中，每天訓(xùn)練4次，每個(gè)象限每天只被使用一次，一定不要將.大鼠連續(xù)地放入同一個(gè)象限，因?yàn)榇笫罂赡軙?huì)憑借位置或其他非記憶信息（如向右轉(zhuǎn)彎）來(lái)定位站臺(tái)。而且，接下來(lái)每天的象限順序應(yīng)當(dāng)改變。在空間探索試驗(yàn)中，將大鼠置于水池中追蹤120s，這個(gè)過(guò)程需要重復(fù)一次，因?yàn)樵谟行┣闆r下，*實(shí)驗(yàn)會(huì)觀察到一些非正常變量，可能一些老鼠在改變了實(shí)驗(yàn)條件后迷失了方向。連續(xù)進(jìn)行的兩次實(shí)驗(yàn)計(jì)算平均值可以減少偏差，可以提供一個(gè)較高的精度和對(duì)先前學(xué)習(xí)記憶的較好控制。但是如果實(shí)驗(yàn)次數(shù)多于兩次，將會(huì)導(dǎo)致在目的象限活動(dòng)時(shí)間減少，得到不準(zhǔn)確的空間探索結(jié)果。

2.3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測(cè)試，如近交系BALB/c小鼠不能學(xué)會(huì)該任務(wù)（成績(jī)并不隨天數(shù)的增加而進(jìn)步），129/SvJ小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)也偏差；比如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關(guān)性視覺(jué)病變，在衰老時(shí)完成以視覺(jué)為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)記憶任務(wù)時(shí)就會(huì)出現(xiàn)困難。在C57BL/6鼠，由于嚴(yán)重的禿頭癥存在，可能使某些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，終可能影響小鼠的游泳能力而影響實(shí)驗(yàn)成績(jī)；將動(dòng)物浸入水中可能引起內(nèi)分泌或其它應(yīng)激效應(yīng)，后者與腦損害或藥理學(xué)操作間的相互作用具有不確定性；由于體力消耗太大，體溫也喪失過(guò)多，一些年老體弱鼠完成任務(wù)較困難，甚至?xí)l(fā)生溺水死亡的情況；另外，個(gè)體間的成績(jī)差異也巨大，比如說(shuō)，有些正常大鼠放入水中后左右觀望打圈確定方向后直接游到臺(tái)上，說(shuō)明他記憶力比較好，這個(gè)現(xiàn)象是很重要的，有的大鼠游泳速度慢些，所以潛伏期時(shí)間比癡呆組還大。所以可以先用別的方法把大鼠初篩一下，然后再來(lái)做水迷宮實(shí)驗(yàn)。

2.4、實(shí)驗(yàn)人員

實(shí)驗(yàn)者應(yīng)與受試動(dòng)物建立良好的感情,讓動(dòng)物熟悉實(shí)驗(yàn)者的身體信息,如氣味、相貌等。捕捉動(dòng)物的動(dòng)作要溫柔,不要刺激動(dòng)物。忌諱用手抓鼠的尾巴,因?yàn)檫@樣會(huì)極大的刺激動(dòng)物。有人建議在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的兩三天之前,與鼠親密接觸。實(shí)際上鼠的嗅覺(jué)很敏感，如實(shí)驗(yàn)人員為女性的話(huà)，其身上的香水味不同，都會(huì)使鼠的情緒發(fā)生變化的。

下一篇文章會(huì)繼續(xù)講解Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法準(zhǔn)則、行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)介紹、實(shí)驗(yàn)適用范圍以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。如果您也喜歡這些文章，歡迎您邀請(qǐng)您的朋友關(guān)注我們，并將文章轉(zhuǎn)發(fā)給需要的老師和同學(xué)，感謝！